產品描述

Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）是用FITC或PE標記了的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發生，可用熒光顯微鏡、流式細胞儀或其他熒光檢測設備進行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。

另外，試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）和7AAD用來區分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI和7AAD為核酸染料，不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI或7AAD聯合使用時，PI和7AAD 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI- or 7AAD-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI- or 7AAD-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI或PE 和7AAD 結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+ or 7AAD+）。

產品組分

·         運輸與保存方法

·             冰袋（wet ice）運輸。本試劑盒中所有組分均在4℃保存，Annexin V-FITC、PI需避光保存。長期不用可將Annexin V-FITC放到-20 ºC保存。

·         使用說明

·         1.1 細胞樣品制備

·           1.a) 懸浮細胞：在進行完細胞凋亡刺激后，1000g，4℃離心5 min收集細胞。
b) 貼壁細胞：把細胞培養液吸出至一合適離心管內（內含已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞），PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶（不含EDTA）消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使細胞發生吹打下來時，吸除胰酶，避免胰酶消化不夠或消化過度。加入收集的細胞培養液，輕輕吹打均勻，轉移到離心管內，1000g，4℃離心5 min。
注意：1）中期凋亡細胞因失去貼壁能力而懸浮于上清中，此部分細胞對于結果是否顯著具有重大影響，不可任意丟棄，需離心收集后一起檢測才能全面反映出細胞凋亡的整體情況；
2）胰酶消化時細胞處理需要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。

·           2.棄上清，用預冷的1ml PBS輕輕重懸細胞并計數（細胞數量不少于10⁵），1000g，4℃離心5 min。收集細胞。
注意：PBS洗掉殘留的胰酶，否則殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，zui終導致染色失敗。

·           3.加入400μl 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞。

·           4.加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。

·           5.加入10μl PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min。

·           6.在30分鐘內進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

·         1.2 樣品分析

·         A．流式細胞儀分析：

·         FITC的綠色熒光激發波長為488 nm，建議在FL1通道檢測；PI的紅色熒光在FL2通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），FL1為橫坐標，FL2為縱坐標。每個樣采集10000 events。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

·         使用流式細胞儀正確分析Annexin V-FITC/PI雙染的細胞前要求儀器的熒光補償來去除兩種染料激發光之間的疊加，不同儀器之間的補償不同。因此需要設置未處理的空白細胞和經Annexin V-FITC、PI分別單染的細胞來調整熒光補償去除光譜重疊。

·         B．熒光顯微鏡分析：

·         1000g，4℃離心5 min，收集細胞，用50-100μl 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞，涂片后，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

·         注意事項

·           1.該試劑盒只能檢測活細胞，而不能用于切片、擦刮、固定或浸潤細胞樣品的檢測。

·           2.由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后盡快檢測。

·           3.如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。

·           4.PBS洗滌細胞，洗掉殘留的胰酶，否則殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，zui終導致染色失敗。

·           5.熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

·           6.如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，從而干擾實驗結果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

·           7.試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

·           8.Annexin V-FITC和PI是光敏物質，在操作時請注意避光。

·           9.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。