新聞中心
News Center膠原在大鼠中成功誘導關節炎方案(CIA)
膠原誘導關節炎(CIA)應用是用Ⅱ型膠原免疫Wistar(遠親雜交)、Sprague-Dawley (遠親雜交)和Wistar-Lewis (近交) 中誘導成功。由于此CIA模型具有與人風濕病關節炎(RA)相同的免疫和病理特征,因此該模型先后擴展到小鼠及非人靈長類動物,并已作為人類關節炎研究的廣泛應用的模型。然而,對于CIA模型來說,不同種屬動物之間是有差異的。小鼠對CIA的敏感性與主要組織相容性復合體(MHC)相關,在小鼠品系中只有DBA/1(H-2q)和B10.RⅢ(H-2r)兩個品系對CIA敏感。大鼠對CIA的敏感性也與MHC相關,并與小鼠相比具有較寬的品系范圍。因此,不同MHC型的不同品系的大鼠,盡管關節炎的發病率、嚴重程度及抗體和T-cell 的特異性在不同品系間不同,但都能夠誘發關節炎。
動物的管理與飼養
動物必須是7-8 周齡健康的并在SPF條件下飼養的動物。一般來說,對于腸道菌群,不管是否致病都顯著影響宿主對抗原的免疫應答。無菌的大鼠對佐劑誘發的關節炎高度易感(AIA),其次是SPF級大鼠及一般大鼠敏感性相對較低。即使同一品系,CIA 的發病率及嚴 重程度也有顯著差異,這種差異是由于飼養條件造成的。
*,小鼠的飲食影響 CIA的發病率及嚴重程度。然而在大鼠在中沒有進行廣泛研究。與小鼠相比,大鼠對Ⅱ型膠原的免疫應答更快且較短時間內能誘發關節炎,因此飲食對小鼠來可能不是影響關節炎的重要因素。然而,像小鼠一樣,飼以高脂肪的食物對誘發關節炎更有利。
大鼠的品系
對Ⅱ型膠原的免疫應答以及關節炎的進展與MHCRT1位點相關而且用于免疫的Ⅱ型膠原的動物來源不同也會造成大鼠對Ⅱ型膠原的免疫應答以及關節炎的進展上的差異。然而,與小鼠相比,很多品系的大鼠對CIA敏感,并能誘發一定程度的關節炎。一般來說,豬的Ⅱ型膠原是的致炎膠原其后是牛的二型膠原,雞的二型膠原致炎性zui差。以下大鼠品系是已明確的對CIA高度易感的品系:BB/DR (RT1u), Wistar Furth, LOU (RT1u), OM (RT1u)和 LEW (RT11) 大鼠。
動物質量也很重要。在這方面,腸道菌群可能是影響機體對二型膠原免疫應答和關節炎進展的重要影響因素之一。例如:Lewis 大鼠對CIA高度易感,同時發病率和炎癥嚴重程度都很高。但是同是SPF級Lewis 大鼠對CIA的敏感性由于年齡、飼養條件及免疫腸道菌而對CIA的敏感性存在顯著差異。MDP(胞壁酰二肽)對加強Lewis 大鼠對CIA的發病率和嚴重程度非常有效。但是我們建議在用Lesis 大鼠造模之前先進行小規模試驗,據我們所知BB大鼠是用于CIA造模的品系。
DA大鼠對CIA的敏感,但是同時AIA(佐劑誘發的關節炎)及礦物油誘發的關節炎(僅礦物油)高度敏感,因此不推薦用于CIA的造模。
注1:與小鼠相反大鼠對同源(大鼠)Ⅱ型膠原是敏感的,同時誘發和猴一樣的關節炎。
注2:與小鼠和猴子相反,大鼠對Ⅱ型膠原抗體是針對Ⅱ型膠原分子構象的特異性抗體。因此膠原變性或免疫Ⅱ型膠原的單獨CB肽段都不能在大鼠中致炎。
膠原
因為去糖基化的膠原會影響關節炎的產生,同時一些未去除的雜質比如:胃蛋白酶可能會導致T細胞刺激試驗中產生假陽性,因此Ⅱ型膠原應按規定高度純化。如果按恰當的方法凍干的膠原-20℃避光保存的條件下,是非常穩定的。純化的膠原溶于0.05M濃度的醋酸中,終濃度為2-4mg/mL,溫和攪拌,4℃過夜。膠原溶液在4℃保存一周,此后需在-20℃保存。Chondrex 公司提供較完整的不同免疫級別的Ⅱ型膠原。(見表1)
表1 不同種屬來源Ⅱ型膠原
Catalog# | Description |
20011 | 雞Ⅱ型膠原,10mg |
20012 | 雞2型膠原, 5 ml x 2 mg/ml |
20021. | 牛2型膠原, 10 mg |
20022 | 牛2型膠原, 5 ml x 2 mg/ml |
20031 | 豬2型膠原, 10 mg |
20032 | 豬2型膠原, 5 ml x 2 mg/ml |
20041 | 大鼠2型膠原, 5 mg |
20042 | 大鼠2型膠原,2.5 ml x 2 mg/ml |
20051 | 人2型膠原, 1 mg |
20052 | 人2型膠原, 0.5 ml x 2 mg/ml |
20061 | 小鼠2型膠原, 1 mg |
20062 | 小鼠2型膠原, 0.5 ml x 2 mg/ml |
乳劑的制備
1)由于大鼠通常對佐劑誘發的關節炎(AIA)是敏感的,因此必須使用不*佐劑(IFA),貨號是7002。乳劑的質量是能否誘發關節炎高發病率的關鍵因素。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導致乳劑不能夠有效的、穩定的誘發關節炎。此外,超聲波處理方法,至少將膠原分成2個片段,這些小片段在正常體溫下,很容易變性。推薦使用電動的高速攪拌器:
用高速攪拌器(帶直徑≤5mm的刀片,Fig.1)攪拌不*佐劑(IFA)和膠原溶液(Fig 2a)。如果刀片夠不到注射器低端,可以把5mL或10mL的注射器從活塞處剪去一半(Fig.2b)。把注射器夾緊,固定在鐵架臺上,并冰浴。zui后一步很重要,因在攪拌過程中會發熱,會引起蛋白變性,變性的蛋白不能夠誘發關節炎(CIA)。
Fig1. 高速攪拌器Fig2 刀片,截斷的注射器,漢密爾頓玻璃注射器、
Fig. 截斷的注射器,支架上固定,冰浴
2)加1體積(zui多2.5mL)不**佐劑到注射器,再加等體積的膠原溶液(0.05M醋酸溶解的的膠原溶液,終濃度2mg/mL),邊低速攪拌邊滴入膠原溶液。
3)繼續混合,直到在zui大轉速產生穩定的乳液(轉速約30000rpm/2-3 min)。在再次混合前確保乳液是冰浴中。對于大體積(2-5Ml)為了使乳液混合均勻,建議在混勻過程中移動攪拌位置。
注:可能需重復攪拌2-3次
4)將一滴乳劑滴與一燒杯水中,檢測乳劑的穩定性。如果乳劑是穩定的,在水中是成團的,不散開。
注:如果乳劑在水面散開,表明乳劑不穩定。再加幾滴佐劑,重新混合后,再檢測。
5)將乳劑轉移到1mL Hamiton 玻璃注射器。不加建議采用塑料注射器,因為很難做到一個準確的注射劑量。
注1:通過用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器(活塞部向下)。否則很難做到一個的注射劑量。
注2:建議在乳劑制備好的一小時內,注射完畢。乳劑在在用前一直保持4℃。
注射部位
在鼠尾根部注射0.2mL(膠原:200μg)乳劑(Fig.4)。例如:從尾根部2cm處插入針頭,直到針尖插入位置距尾根部0.5cm。針插入皮下且每次注射充分擦拭,防止乳液的露出。針頭沿斜向上與鼠尾方向平行插入。如果要加強免疫,注射部位在尾根部3Cm處,針尖插入皮下據鼠尾根部1.5cm處。
注1:背部皮下注射也非常有效,但需注射更多的膠原乳劑(0.5-1Ml)。
注2:無論如何,我們不建議背部皮下注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑,如初次免疫或加強免疫。因為不*佐劑在腹膜和腹腔引起嚴重的炎癥反應。
圖4:皮下免疫乳劑
免疫程序
Ⅱ型膠原的自身IgG抗體水平及其亞型(可激活補體),對關節炎的發生很重要。依據實驗目的有很多種方法可誘發高發病率的關節炎。
依據說明書方法制備乳劑(膠原-不*佐劑)和免疫,由于不同品系的的敏感性的差異,一般在2-3周可誘發關節炎。在一些免疫應答較強的品系,發病率達到80-90%。對于一些高度易感品系如BB大鼠,關節炎嚴重程度,臨床評分可達到10-12分(zui高16分)。
b 通過加強免疫誘發關節炎
為了確保關節炎的發病率和嚴重度,可在初次免疫7天后加強免疫。按說明書方法,準備膠原-不*佐劑,尾部皮下注射0.1mL,會短時間內產生嚴重的關節炎。
按要求制備膠原+IFA 乳劑(1:1)
初次免疫(0day) :200 ul 乳劑/只
加強免疫(7day):100ul 乳劑/只
c 用人工合成的胞壁酰二肽作為佐劑誘導關節炎
*弗氏佐劑含滅活的結核桿菌,不能和二型膠原合用免疫大鼠。但是,可以用另一種佐劑MDP(N-acetylmuramyl-alanyl-D-isoglutamine hydrate) 用于免疫。用雙蒸水溶解MDP至4-8mg/ mL。 膠原溶解于0.5M的醋酸中,終濃度為4mg/ mL。免疫前等體積混合MDP和膠原溶液。將MDP-膠原混合物和等體積的IFA(不*佐劑)按上述方法混合。尾部皮下注射0.2 mL。與僅使用不*佐劑相比,這種方法在關節炎的發病率、嚴重性和一致性(實驗批間)都會大大提高。
注:單獨使用高劑量(0.8mg/只)的MDP也能誘發關節炎。因此,建議依據不同品系,優化使用MDP劑量。不要在DA大鼠使用這種方法。
關節炎的發生
于小鼠相比(約4周),關節炎在大鼠中產生的更快,初次免疫后,2-3周出現關節腫脹。在BB大鼠發生關節炎的時間比其它品系更快,約12-14天。如果免疫有效,3周后100%發生關節炎。
臨床評分
關節炎可通過臨床評分來定性評估或用測厚儀來測量爪子厚度來評估。這些方法適用于所有的關節炎模型比如經典的CIA,佐劑誘導的關節炎和棉線誘導的關節炎。
表2 關節炎炎癥程度的臨床評分
得分 | 發病情況 |
0 | 正常 |
1 | 輕度的、踝關節、腕關節發紅、腫脹 |
2 | 踝關節或腕關節中度發紅腫脹 |
3 | 爪子嚴重發紅、腫脹,包括指端 |
4 | 四肢zui大程度發炎,包括多關節。 |