DEAE-SephadexA-50（二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50）為弱堿性陰離子交換劑。用NaOH將CL^-型轉變為OH^-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白（等電點為PH6.85～7.5），其余均屬酸性蛋白。在PH7.2～7.4的環境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱層析是離子交換層析的一種。

　　（二）試劑和器材

　　1、試劑:

　　（1）鹽析提取的人γ球蛋白；

　?。?）0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3；

　?。?）DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇（PEG）；

　?。?）0.1M, PH7.4 PB（配制見鹽析部分）；

　　2、器材:

　　（1）層析玻璃柱（1.3×40cm），滴定鐵架，自由夾，螺旋夾，尼龍紗（200目）；

　?。?）普通冰箱，751桮型紫外分光光度計，電導儀、抽濾裝置（包括抽氣機、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮墊圈、抽濾瓶），PH計；

　　（3）透析袋、座標紙、濾紙、PH精密試紙；

　?。?）量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等。

　　（三） 操作步驟

　　1、DEAE-Sephadex A-50預處理

　　稱DEAE-Sephadex A-50（下稱A-50）5克，懸于500ml蒸餾水，1小時后傾去上層細粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，將A-50浸泡于0.5N NaOH中，攪勻，靜置30分鐘，裝入布氏漏斗（墊有2層濾紙）中抽濾，并反復用蒸餾水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作過程處理，zui后以0.5N NaOH再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中過夜。

　　2、裝柱

　　（1）將層析柱垂直固定于滴定鐵架上，柱底墊一園尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。

　?。?）將0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2-3cm厚時，啟開出水口螺旋夾，控制流速1ml/分鐘，同時連續倒入糊狀A-50凝膠至所需高度。

　　（3）關閉出水口，待A-50凝膠*沉降后，柱面放一園形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。

　　3、平衡:啟開出水口螺旋夾，控制流速12-14滴/分鐘，使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之PH值與離子強度是否相同。達到一致時關閉出水口，停止平衡。

　　4、加樣及洗脫:

　　啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當柱面液體與柱面相切時，立即關閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品（體積應<床體積的2％，蛋白濃度以<100mg為宜）。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進入柱內，至與柱面相切時，立即關閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數ml洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統。并控制流速12～14滴／分鐘。

　　5.　收集：開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。

　　6.　測蛋白：以751-G型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm，與OD260nm，按前述公式計算各管蛋白含量。并以OD280nm為縱座標，以試管編號為橫座標，繪制洗脫曲線。

　　7.　合并、濃縮：將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以PEG（MW6000）洗縮至所需體積，加入0.02％NaN３防腐劑，于4℃保存備用。

　　8.　A-50凝膠的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的雜蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預處理過程將A-50再處理一遍即達再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中４℃保存；近期不用時，以*洗2次，再置50℃溫箱烘干，裝瓶內保存。

　　（四）　注意事項

　　1.　柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就得獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使液體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。

　　2.　純化過程必須嚴格控制脫緩沖液的PH及離子強度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液*平衡后，才能進行柱層析。

　　3.　所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應重裝。

　　4.　洗脫過程中應嚴格控制流速，且勿過快。

　　5.　上樣的體積要小，濃度不宜過高。

　　6.　加樣及整個洗脫過程中，嚴防柱面變干。