丙酮酸激酶PK是糖酵解途徑的一個關鍵酶，目前研究表明，幾乎所有不同組織來源的腫瘤均伴有丙酮酸激酶的異構重整體M2-PK的過度表達, 故稱為腫瘤型M2-PK（Tumor M2-PK，Tu M2-PK）。在正常細胞中，M2-PK主要以三聚體的形式存在，而在腫瘤細胞中，M2-PK大量表達并轉變為主要以二聚體的形式存在。三聚體的M2-PK與磷酸烯醇丙酮酸PEP親和力很高，而二聚體的M2-PK與PEP的親和力則低的多，后者因此導致磷酸烯醇類物質的堆積，這有利于腫瘤細胞進行無氧糖酵解。

Tu M2-PK的升高可見于大多數癌癥患者。盡管不同組織來源的腫瘤或同種腫瘤的不同階段，其血中M2-PK的平均水平存在著一定的差別，但作為腫瘤標志物，M2-PK是很有應用價值的。尤其是腎癌，長期以來一直未發現較特異的腫瘤標志物,M2-PK很可能成為目前*可用于臨床診斷腎癌的生化指標。早在1993年，在Hamburg召開的（德國）第七界腫瘤標志物研討會上，Tu M2-PK就作為一種新的腫瘤標志物被提了出來。不過，比較其特異性而言，Tu M2-PK的靈敏度相對偏低。所以，用于診斷和篩選腫瘤患者，Tu M2-PK還應與其他有關的腫瘤標志物聯合檢測，以同時提高臨床診斷的特異性和靈敏度。

本試劑盒能靈敏的高特異性地檢測出人體血液內的Tu M2-PK------一種可以用于癌癥的篩查、診斷和跟蹤治療的新的腫瘤標記物。

本實驗采用雙抗體夾心法原理，抗人M2-PK單抗包被于酶標板上，標準品和EDTA血漿標本中的M2-PK就會與板上的單抗結合，被固定，通過洗板，將未結合的游離成分洗去；再加入生物素化的M2-PK的抗體和辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素和親合素特異性結合；抗人M2-PK抗體與結合在單抗上的M2-PK結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應孔中有M2-PK，辣根

 

 

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過氧化物酶會使無色的顯色劑顯藍色，加終止液變黃，在450nm處測OD值，M2-PK濃度與所測OD450值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中M2-PK濃度。

包被有腫瘤M2-PK單克隆抗體的酶標板（12ⅹ8孔）

腫瘤M2-PK標準品1→4個  4×1.0 ml         質控液           1×1.0 ml

腫瘤M2-PK多抗           1×10 ml          酶聯物           2×6.0 ml

濃縮洗滌液（25ⅹ）        1×20 ml          底物A           1×6.0ml

濃縮標本稀釋液（10×）    1×10 ml          底物B           1×6.0ml 

終止液                    1×6.0ml

血漿抗凝劑只能使用EDTA，其他血漿均不能使用。建議1-2小時內離心，避免劇烈搖動。（2000g離心十分鐘）。標本在4⁰C可以保存一天，在-20⁰C可以保存一年。標本收集后若不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融。

1．   500ml的量筒;  2 ml、5 ml、10 ml的吸管;  酶標儀（450+10nm）一臺

2．   微量加樣器：0-50μl，50-200μl，200-1000μl

可行的加樣板設計:

S1~S42：EDTA血漿標本       Blank：吸入100微升標本洗滌液在A1和A2孔

 

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STD：    標準品             PC：  質控液

標準品：在*條和第二條孔中各加入100微升標準品，作為對照實驗

1號標準品=8U/ml             2號標準品=15U/ml

3號標準品=35U/ml            4號標準品=50U/ml

1.        標準品和質控液的準備：向盛有標準品和質控液的小瓶中各加入500μl標本稀釋液，并充分混勻。

2.        質控液： 20U/ml±10%  在F1和F2孔中各加100μl。

3.        標本洗滌液的準備： 20ml濃縮洗滌液（25ⅹ）+400ml蒸餾水，此份稀釋液在4-8⁰C可保存六周。

4.        標本稀釋液的準備： 用蒸餾水按1：10稀釋，稀釋后放2-8℃保存。

5.        酶標板的準備： 在打開之前把酶標板置于室溫，取需要量的酶標板置于框架內，未使用的酶標板于有干燥劑的密封塑料袋中保存。

6.       EDTA血漿的稀釋（1：100）: 10μl EDTA血漿+1ml標本稀釋液，充分混合。

7.        按照待測標本數目取相應的酶標板條于框架上，除空白孔外，分別將標本和不同濃度的標準品、質控液（100μl/孔）加入相應孔中（做雙孔），振蕩均勻，于37⁰C，溫育60min。

8.        取出反應的酶標板條，倒掉孔內的液體，加入標本洗滌液洗滌5次，于干凈的紙上拍干，除去殘留的液體，向每孔中加入M2-PK多抗100μl，振蕩均勻，于37⁰C，溫育30min。

9.        取出反應的酶標板條，倒掉孔內的液體，加入標本洗滌液洗滌5次，于干凈的紙上拍干，除去殘留的液體，向每孔中加入酶聯物100μl，振蕩均勻，于37⁰C，溫育30min。

10.     取出反應的酶標板條，倒掉孔內的液體，加入標本洗滌液洗滌5次，于干凈的紙上拍干，除去殘留的液體，向每孔中加入A、B底物各50μl，振蕩均勻，于37⁰C，溫育10-15min。

10.  取出反應的酶標板條，立即向每孔中加入50μl終止液，于5分鐘內在450 nm處用酶標儀讀出吸光度。

結果判斷：以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐c標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

參考濃度≤15U M2-PK/ml  EDTA 血漿，對應90%的參照組除腫瘤病還感染有其他疾病。

含量在15-20U/ml的數值為不確定的可疑血漿。

1．   所有的試劑和酶標板在使用之前均要平衡至室溫。

2．   使用前應搖勻所有的液體試劑，但要防止瓶蓋上沾有試劑。

3．   操作時應該按照相同的程序操作和相同的時間間隔。

4．   為了避免污染，使用干凈的加樣器吸管和干凈的容器，不要使用同一個容器來盛裝不同的試劑。

5．   每次洗滌時要倒置酶標板于干凈的紙巾上拍打，除去殘留液體，避免液體回濺，培養過程中的洗滌每次至少要1分鐘。

6．   加試劑和樣本之后應振蕩酶標板以保證試劑的均勻分布，若有泡沫請用干凈的針除去。

7．   實驗操作過程中要注意安全，避免皮膚直接接觸標準品、質控液，更不能用嘴吸液，要帶手套，不同批號的材料不要混用。

8．  操作完成要按照說明妥善保管好各種試劑。

1. 本試驗結果需結合臨床表現、病史及其他診斷結果方可采取適當臨床處理。

2. 2－8℃貯存,貯存至有效期結束；不同批號的試劑不能混用，標本稀釋液及酶聯物不能凍結。本試劑盒有效期九個月。